B-vector

こんにちは。みなさんはblunt-end cloningどうしてます？

Proof-reading (校正) 活性のあるポリメラーゼを使ったPCR産物はTaqポリメラーゼと違って末端にA突出がなく平滑末端になっています。そのためベクターとのライゲーションはTAクローニングではなくblunt-endクローニングになります。これがむずかしい。

自作でblunt-end用のベクターをつくっている人もいると思いますが、どうでしょう。
入らざること山の如しですよね。

僕も自作でblunt-end用ベクター（僕は勝手にB-ベクターと呼んでいます）をつくってトライするのですがきちんと入ったことがほぼありません。

ちなみに定法に従い次のように作っていました。

（以下はあまりworkしないB-vectorの作り方です。参考になりません。）
 ベクターを平滑末端を生じる制限酵素（EcoRVやSmaIなど）でカット。
 ゲル電気泳動後、ゲル片からのDNA精製を行い切れたベクターのみを回収。
 回収産物をアルカリフォスファターゼ (SAPやCIAP) で処理し、末端のリン酸基を除去（ベクター末端同士のセ ルフライゲーションを防ぐため）。
 精製後小分けして冷凍保存。

白コロニーは出るが目的のDNAは入っていなかった。なぜかベクターが削れてつながっているもの多し。

何度きちんと作ってもつながらないのでいつもPCR産物側をさらに処理してTAクローニングに逃げていました。 また、高いのですがInvitrogen (Thermo FisherScientific) のTOPO cloning kitも使ったことがあります。

Blunt-end用のTOPO kitは目をつぶってやっても入るんじゃないかというくらいバシバシ入ってくれるのですが、いかんせん高い（1回のクローニングで3500円くらいかかる）。もはやそんな豪遊はできないので何とかできないかとずっと思いつつ毎回苦労していました。

そして先日久しぶりにblunt-endクローニングをやってみたのですが、またもや入らないので今度こそはと解決策をいろいろ考えた結果、結論が出ました。そしてそれなりにうまくつながる方法が分かったので紹介します。

リアルタイムPCRとネガコン２

混ざったね・・・。

水でも増えてくるというみなさま。あらためてこんにちは。前回の投稿（→リンク）のつづきです。

前回はリアルタイムPCRで水しか入れていないネガコンが増えてきてしまうという内容でした。これを書いている僕も水で増やしちゃったほうです。どうやったら増えなくなるか。検討していくつかの解決策を提案します。長い投稿になりますがこのおかげで研究室では安定してネガコンで増幅がなくなりました。

３つのポイントがあります。何が混入するか、どこから混入するか、どのタイミングで混入するか、です。

リアルタイムPCRとネガコン

グレイト！！

 
皆さんこんにちは。

僕が学生のときになぜか時々混入してくるプラスミドがありました。
実験で使っているプラスミドにインサートを組み込んだ後、大腸菌に形質転換して、青/白セレクションで白コロニーをとってくる。そしてそれを液体培地で増やして、プラスミドを抽出し、電気泳動すると・・・

「・・・なんだきみは？」

長さも制限酵素切断パターンも何もかも使ったものとは違うプラスミドが増えている。

白コロニーの多くは正しいのですが、時々そのへんなプラスミドが混ざっていることがあるのです。これを僕らの研究室では謎プラとよんでいました。謎プラに該当するプラスミドが何なのか制限酵素切断箇所やプラスミドのサイズなどからいろいろ調べてみたのですがわからずじまい（シークエンスまではやりませんでした）。結局あいつは何だったのだろうか。今でも謎のままです。

おそらく試薬や水など、どこかに謎プラが混入（コンタミ）していたのでしょう。あるいは形質転換に使った大腸菌の中にもともと入っていたのかもしれません。 この時はコンタミの頻度が低かったため正しいプラスミドを選んで実験すればよかったので、それほど害はありませんでした。しかし実験の内容によってはコンタミが多大な影響を与える場合があります。

その１つがリアルタイムPCRを使った定量実験です。

リアルタイム定量PCR実践講座

おはようございます。

先日１１月１５日と１６日にゲノム研究分野において実技トレーニングコース『リアルタイム定量PCR実践講座』を開催しました。

２日間にわたる長めのコースでしたが当日は多数の方にご参加いただきました。ありがとうございました。

本実技トレーニングコースでは以下のスケジュールで参加者の皆さんに実験室にてリアルタイムPCR実験を行ってもらいました。

１日目 (11/15 火)
1.    本コースに関する説明            (9:30-9:40)
2.    リアルタイムPCRの原理         (9:40-10:00)
3.    逆転写反応                             (10:00-11:00)
4.    実験計画の立て方                 (10:30-11:00)  (※3の反応中に実施）
5.    条件検討その１                      (11:05-12:00)
           遺伝子増幅の確認と基準Ct値の確認 (1st PCR)
6.    プライマーの設計について     (13:30-14:00)
7.    条件検討その２                       (14:00-15:30)
            検量線範囲の設定 (2nd PCR)
8.    （予備時間）質問等。              (15:30-16:00)

２日目 (11/16 水)
7.    条件検討その２つづき （前日の結果確認と解説）        (9:30-10:00)
8.    リアルタイムPCR本実験 （遺伝子発現量の比較）        (10:05-12:00)
9.    結果の確認と解析操作、解説                                        (13:30-14:30)
10.   質問等（希望者は再実験。）                                          (14:30-16:00)



リアルタイムPCR実験では高感度で目的遺伝子の発現量が解析できるできるというメリットがある反面、ごく少量のコンタミネーションで実験結果に大きな影響が生じるという実験者泣かせのデメリットもあります。

開催前はきちんとした結果が出るかどうか不安もありましたが、今回参加の皆さんがとても上手に実験操作をしていただいたおかげで大変良い結果（お世辞ではない）で終わることができました。

ゲノム研究分野では今後も実技トレーニングコースを予定しています。次回の日程は未定ですが、内容等の希望がありましたら、ゲノム研究分野HP（→リンク）から、または以下のアドレスにお知らせください。

生命科学総合研究支援センター
ゲノム研究分野 mgrc@gifu-u.ac.jp

いまさら聞けないＰＣＲ

先日、ゲノム研究分野主催のバイオトレンドセミナー
「いまさら聞けないPCRの基礎と応用」を開催しました。

６８人のかたに参加いただきました。多数の申し込みをいただいたので場所を共通教育棟１階 1A教室に変更しての開催になりました。参加された皆様、どうもありがとうございました。

当日はTAKARAバイオの大場博士にPCRの基礎から色々なタイプの酵素を使ったPCR実験の応用例までを解説していただきました。

参加者限定の特別キャンペーンが１２月２５日までなので、欲しい試薬がある方は忘れずにご注文くださいね。

ゲノム研究分野

スーパーTベクター

実験をしていると原因不明の失敗は度々あります。方法や試薬を変えてみてもうまく行かず、何度か繰り返すうちいつの間にか成功して、一体何が原因だったんだと思うこともよくあります。

おそらく方法や試薬ではなく手技の上達が問題を解決したのかも知れませんが、こういうのは永遠の謎です。

一方で原因不明の成功はあまり経験がありません。ところが先日久々にT-ベクターをつくったところ、やたらといいものができたのでちょっと紹介します。

先端生命科学の２大革命 つづき

１１月２９日に生命科学総合研究支援センターの公開講座が公開されます（→参考リンク）。
これに関連して過去の公開講座の内容を紹介しています。

今回の投稿は前回のつづきになります。

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(2013年 公開講座より）

先端生命科学の２大革命

iPS細胞と次世代遺伝子診断

（前回の続きです）

超高速シーケンサーによる遺伝子解析と健康への応用
現在ヒトの全遺伝子配列を短時間ですべて解読する為の機器の開発が進んでいます。それらの機器は次世代シーケンサーと呼ばれ、ヒト一人分の全遺伝子配列（DNAの全情報）を数時間のうちに解読してしまいます。全遺伝子配列を解読することで病気や体質に関係する遺伝子の個人差を発見することができ、病気の診断や治療、予防に役立つと期待されています。次は次世代の遺伝子診断について紹介します。