PCRプレート用のヘラ

あんまりゴリゴリ押すんじゃないよ。

プレートPCR愛好者の皆様。朗報です。

PCRを使った変異/キメラコンストラクトの作成（後編）

前回の続きです。

1st PCRでは目的の遺伝子を2つのフラグメントに分けて5サイクルだけの増幅を行い、増えてきたPCR産物を電気泳動で分離して精製しました。続いて1st PCR産物をつなぐための反応を行います。この方法には2通りあります。

まずは簡単なほうから説明します。

PCRを使った変異/キメラコンストラクトの作成（前編）

 遺伝子の機能を解析するために特定の塩基を変更したり取り除いたりしてアミノ酸置換やフレームシフトを誘導してその影響を調べたいことがあります。


あるいは対象とする遺伝子とGFPの遺伝子をつなげて融合タンパクを作って細胞内局在を見たいといったこともよくあります。

今回はPCRで遺伝子変異の誘導や融合遺伝子の作成を行う手順を紹介します。
材料となる遺伝子のcDNAは得られているものとします。

B-vector

こんにちは。みなさんはblunt-end cloningどうしてます？

Proof-reading (校正) 活性のあるポリメラーゼを使ったPCR産物はTaqポリメラーゼと違って末端にA突出がなく平滑末端になっています。そのためベクターとのライゲーションはTAクローニングではなくblunt-endクローニングになります。これがむずかしい。

自作でblunt-end用のベクターをつくっている人もいると思いますが、どうでしょう。
入らざること山の如しですよね。

僕も自作でblunt-end用ベクター（僕は勝手にB-ベクターと呼んでいます）をつくってトライするのですがきちんと入ったことがほぼありません。

ちなみに定法に従い次のように作っていました。

（以下はあまりworkしないB-vectorの作り方です。参考になりません。）
 ベクターを平滑末端を生じる制限酵素（EcoRVやSmaIなど）でカット。
 ゲル電気泳動後、ゲル片からのDNA精製を行い切れたベクターのみを回収。
 回収産物をアルカリフォスファターゼ (SAPやCIAP) で処理し、末端のリン酸基を除去（ベクター末端同士のセ ルフライゲーションを防ぐため）。
 精製後小分けして冷凍保存。

白コロニーは出るが目的のDNAは入っていなかった。なぜかベクターが削れてつながっているもの多し。

何度きちんと作ってもつながらないのでいつもPCR産物側をさらに処理してTAクローニングに逃げていました。 また、高いのですがInvitrogen (Thermo FisherScientific) のTOPO cloning kitも使ったことがあります。

Blunt-end用のTOPO kitは目をつぶってやっても入るんじゃないかというくらいバシバシ入ってくれるのですが、いかんせん高い（1回のクローニングで3500円くらいかかる）。もはやそんな豪遊はできないので何とかできないかとずっと思いつつ毎回苦労していました。

そして先日久しぶりにblunt-endクローニングをやってみたのですが、またもや入らないので今度こそはと解決策をいろいろ考えた結果、結論が出ました。そしてそれなりにうまくつながる方法が分かったので紹介します。

リアルタイムPCRとネガコン２

混ざったね・・・。

水でも増えてくるというみなさま。あらためてこんにちは。前回の投稿（→リンク）のつづきです。

前回はリアルタイムPCRで水しか入れていないネガコンが増えてきてしまうという内容でした。これを書いている僕も水で増やしちゃったほうです。どうやったら増えなくなるか。検討していくつかの解決策を提案します。長い投稿になりますがこのおかげで研究室では安定してネガコンで増幅がなくなりました。

３つのポイントがあります。何が混入するか、どこから混入するか、どのタイミングで混入するか、です。

リアルタイムPCRとネガコン

グレイト！！

 
皆さんこんにちは。

僕が学生のときになぜか時々混入してくるプラスミドがありました。
実験で使っているプラスミドにインサートを組み込んだ後、大腸菌に形質転換して、青/白セレクションで白コロニーをとってくる。そしてそれを液体培地で増やして、プラスミドを抽出し、電気泳動すると・・・

「・・・なんだきみは？」

長さも制限酵素切断パターンも何もかも使ったものとは違うプラスミドが増えている。

白コロニーの多くは正しいのですが、時々そのへんなプラスミドが混ざっていることがあるのです。これを僕らの研究室では謎プラとよんでいました。謎プラに該当するプラスミドが何なのか制限酵素切断箇所やプラスミドのサイズなどからいろいろ調べてみたのですがわからずじまい（シークエンスまではやりませんでした）。結局あいつは何だったのだろうか。今でも謎のままです。

おそらく試薬や水など、どこかに謎プラが混入（コンタミ）していたのでしょう。あるいは形質転換に使った大腸菌の中にもともと入っていたのかもしれません。 この時はコンタミの頻度が低かったため正しいプラスミドを選んで実験すればよかったので、それほど害はありませんでした。しかし実験の内容によってはコンタミが多大な影響を与える場合があります。

その１つがリアルタイムPCRを使った定量実験です。

リアルタイム定量PCR実践講座

おはようございます。

先日１１月１５日と１６日にゲノム研究分野において実技トレーニングコース『リアルタイム定量PCR実践講座』を開催しました。

２日間にわたる長めのコースでしたが当日は多数の方にご参加いただきました。ありがとうございました。

本実技トレーニングコースでは以下のスケジュールで参加者の皆さんに実験室にてリアルタイムPCR実験を行ってもらいました。

１日目 (11/15 火)
1.    本コースに関する説明            (9:30-9:40)
2.    リアルタイムPCRの原理         (9:40-10:00)
3.    逆転写反応                             (10:00-11:00)
4.    実験計画の立て方                 (10:30-11:00)  (※3の反応中に実施）
5.    条件検討その１                      (11:05-12:00)
           遺伝子増幅の確認と基準Ct値の確認 (1st PCR)
6.    プライマーの設計について     (13:30-14:00)
7.    条件検討その２                       (14:00-15:30)
            検量線範囲の設定 (2nd PCR)
8.    （予備時間）質問等。              (15:30-16:00)

２日目 (11/16 水)
7.    条件検討その２つづき （前日の結果確認と解説）        (9:30-10:00)
8.    リアルタイムPCR本実験 （遺伝子発現量の比較）        (10:05-12:00)
9.    結果の確認と解析操作、解説                                        (13:30-14:30)
10.   質問等（希望者は再実験。）                                          (14:30-16:00)



リアルタイムPCR実験では高感度で目的遺伝子の発現量が解析できるできるというメリットがある反面、ごく少量のコンタミネーションで実験結果に大きな影響が生じるという実験者泣かせのデメリットもあります。

開催前はきちんとした結果が出るかどうか不安もありましたが、今回参加の皆さんがとても上手に実験操作をしていただいたおかげで大変良い結果（お世辞ではない）で終わることができました。

ゲノム研究分野では今後も実技トレーニングコースを予定しています。次回の日程は未定ですが、内容等の希望がありましたら、ゲノム研究分野HP（→リンク）から、または以下のアドレスにお知らせください。

生命科学総合研究支援センター
ゲノム研究分野 mgrc@gifu-u.ac.jp