これはペンですか？

Is this a pen? Is this a pen, which can not be easily removed by ethanol?

「ZEBRA マッキー極細」 チューブの蓋以外の用途には悪くはない。

チューブの蓋に書いたラベルが、エタノールで拭いたら綺麗サッパリ消えて中身がわからなくなった。 という方どれくらいいるでしょうか。少なくともここには一人います。

プラスミドを使ったコンピテントセルのトランスフォーメーション

以前の投稿でコンピテントセル（ケミカルコンピテントセル）の作成方法を紹介しました。今回は実際にコンピテントセルにプラスミドを導入する方法（トランスフォーメーション）を紹介します。

PCRプレート用のヘラ

あんまりゴリゴリ押すんじゃないよ。

プレートPCR愛好者の皆様。朗報です。

PCRを使った変異/キメラコンストラクトの作成（後編）

前回の続きです。

1st PCRでは目的の遺伝子を2つのフラグメントに分けて5サイクルだけの増幅を行い、増えてきたPCR産物を電気泳動で分離して精製しました。続いて1st PCR産物をつなぐための反応を行います。この方法には2通りあります。

まずは簡単なほうから説明します。

PCRを使った変異/キメラコンストラクトの作成（前編）

 遺伝子の機能を解析するために特定の塩基を変更したり取り除いたりしてアミノ酸置換やフレームシフトを誘導してその影響を調べたいことがあります。


あるいは対象とする遺伝子とGFPの遺伝子をつなげて融合タンパクを作って細胞内局在を見たいといったこともよくあります。

今回はPCRで遺伝子変異の誘導や融合遺伝子の作成を行う手順を紹介します。
材料となる遺伝子のcDNAは得られているものとします。

B-vector

こんにちは。みなさんはblunt-end cloningどうしてます？

Proof-reading (校正) 活性のあるポリメラーゼを使ったPCR産物はTaqポリメラーゼと違って末端にA突出がなく平滑末端になっています。そのためベクターとのライゲーションはTAクローニングではなくblunt-endクローニングになります。これがむずかしい。

自作でblunt-end用のベクターをつくっている人もいると思いますが、どうでしょう。
入らざること山の如しですよね。

僕も自作でblunt-end用ベクター（僕は勝手にB-ベクターと呼んでいます）をつくってトライするのですがきちんと入ったことがほぼありません。

ちなみに定法に従い次のように作っていました。

（以下はあまりworkしないB-vectorの作り方です。参考になりません。）
 ベクターを平滑末端を生じる制限酵素（EcoRVやSmaIなど）でカット。
 ゲル電気泳動後、ゲル片からのDNA精製を行い切れたベクターのみを回収。
 回収産物をアルカリフォスファターゼ (SAPやCIAP) で処理し、末端のリン酸基を除去（ベクター末端同士のセ ルフライゲーションを防ぐため）。
 精製後小分けして冷凍保存。

白コロニーは出るが目的のDNAは入っていなかった。なぜかベクターが削れてつながっているもの多し。

何度きちんと作ってもつながらないのでいつもPCR産物側をさらに処理してTAクローニングに逃げていました。 また、高いのですがInvitrogen (Thermo FisherScientific) のTOPO cloning kitも使ったことがあります。

Blunt-end用のTOPO kitは目をつぶってやっても入るんじゃないかというくらいバシバシ入ってくれるのですが、いかんせん高い（1回のクローニングで3500円くらいかかる）。もはやそんな豪遊はできないので何とかできないかとずっと思いつつ毎回苦労していました。

そして先日久しぶりにblunt-endクローニングをやってみたのですが、またもや入らないので今度こそはと解決策をいろいろ考えた結果、結論が出ました。そしてそれなりにうまくつながる方法が分かったので紹介します。

リアルタイムPCRとネガコン２

混ざったね・・・。

水でも増えてくるというみなさま。あらためてこんにちは。前回の投稿（→リンク）のつづきです。

前回はリアルタイムPCRで水しか入れていないネガコンが増えてきてしまうという内容でした。これを書いている僕も水で増やしちゃったほうです。どうやったら増えなくなるか。検討していくつかの解決策を提案します。長い投稿になりますがこのおかげで研究室では安定してネガコンで増幅がなくなりました。

３つのポイントがあります。何が混入するか、どこから混入するか、どのタイミングで混入するか、です。