リアルタイムPCRとネガコン２

混ざったね・・・。

水でも増えてくるというみなさま。あらためてこんにちは。前回の投稿（→リンク）のつづきです。

前回はリアルタイムPCRで水しか入れていないネガコンが増えてきてしまうという内容でした。これを書いている僕も水で増やしちゃったほうです。どうやったら増えなくなるか。検討していくつかの解決策を提案します。長い投稿になりますがこのおかげで研究室では安定してネガコンで増幅がなくなりました。

３つのポイントがあります。何が混入するか、どこから混入するか、どのタイミングで混入するか、です。

リアルタイムPCRとネガコン

グレイト！！

 
皆さんこんにちは。

僕が学生のときになぜか時々混入してくるプラスミドがありました。
実験で使っているプラスミドにインサートを組み込んだ後、大腸菌に形質転換して、青/白セレクションで白コロニーをとってくる。そしてそれを液体培地で増やして、プラスミドを抽出し、電気泳動すると・・・

「・・・なんだきみは？」

長さも制限酵素切断パターンも何もかも使ったものとは違うプラスミドが増えている。

白コロニーの多くは正しいのですが、時々そのへんなプラスミドが混ざっていることがあるのです。これを僕らの研究室では謎プラとよんでいました。謎プラに該当するプラスミドが何なのか制限酵素切断箇所やプラスミドのサイズなどからいろいろ調べてみたのですがわからずじまい（シークエンスまではやりませんでした）。結局あいつは何だったのだろうか。今でも謎のままです。

おそらく試薬や水など、どこかに謎プラが混入（コンタミ）していたのでしょう。あるいは形質転換に使った大腸菌の中にもともと入っていたのかもしれません。 この時はコンタミの頻度が低かったため正しいプラスミドを選んで実験すればよかったので、それほど害はありませんでした。しかし実験の内容によってはコンタミが多大な影響を与える場合があります。

その１つがリアルタイムPCRを使った定量実験です。