こんにちは。みなさんはblunt-end cloningどうしてます？
Proof-reading (校正) 活性のあるポリメラーゼを使ったPCR産物はTaqポリメラーゼと違って末端にA突出がなく平滑末端になっています。そのためベクターとのライゲーションはTAクローニングではなくblunt-endクローニングになります。これがむずかしい。
自作でblunt-end用のベクターをつくっている人もいると思いますが、どうでしょう。
入らざること山の如しですよね。
僕も自作でblunt-end用ベクター（僕は勝手にB-ベクターと呼んでいます）をつくってトライするのですがきちんと入ったことがほぼありません。
ちなみに定法に従い次のように作っていました。
（以下はあまりworkしないB-vectorの作り方です。参考になりません。）
ベクターを平滑末端を生じる制限酵素（EcoRVやSmaIなど）でカット。
ゲル電気泳動後、ゲル片からのDNA精製を行い切れたベクターのみを回収。
回収産物をアルカリフォスファターゼ (SAPやCIAP) で処理し、末端のリン酸基を除去（ベクター末端同士のセ ルフライゲーションを防ぐため）。
精製後小分けして冷凍保存。
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| 白コロニーは出るが目的のDNAは入っていなかった。なぜかベクターが削れてつながっているもの多し。 |
何度きちんと作ってもつながらないのでいつもPCR産物側をさらに処理してTAクローニングに逃げていました。 また、高いのですがInvitrogen (Thermo FisherScientific) のTOPO cloning kitも使ったことがあります。
Blunt-end用のTOPO kitは目をつぶってやっても入るんじゃないかというくらいバシバシ入ってくれるのですが、いかんせん高い（1回のクローニングで3500円くらいかかる）。もはやそんな豪遊はできないので何とかできないかとずっと思いつつ毎回苦労していました。
そして先日久しぶりにblunt-endクローニングをやってみたのですが、またもや入らないので今度こそはと解決策をいろいろ考えた結果、結論が出ました。そしてそれなりにうまくつながる方法が分かったので紹介します。
